Chemie • Materialwissenschaften • Strukturbiologie

Forschungsbericht (importiert) 2011 - Max-Planck-Institut für Intelligente Systeme

Die süße Hülle lebender Zellen – von der supramolekularen Struktur und Dynamik zur biologischen Funktion

The sweet coat of living cells – from supramolecular organization and dynamics to biological function

Autoren

Richter, Ralf

Abteilungen

Selbständige Forschungsgruppe – Modellsysteme glykanhaltiger Zellhüllen
Max-Planck-Institut für Intelligente Systeme, Stuttgart (vormals Max-Planck-Institut für Metallforschung)

Viele lebende Zellen statten sich mit einer zuckerhaltigen Hülle aus, die eine Schlüsselrolle beim Schutz der Zelle und bei der Strukturierung und Kommunikation mit ihrer Umgebung spielt. Eine herausragende Eigenschaft dieser perizellularen Hüllen ist ihre dynamische Selbstorganisation in stark hydratisierte, gelartige Netzwerke. Maßgeschneiderte Modellsysteme, die aus den molekularen Bausteinen der perizellularen Hüllen aufgebaut werden, können verstehen helfen, wie die Zellhüllen funktionieren.
Many biological cells endow themselves with a sugar-rich coat that plays a key role in the protection of the cell and in structuring and communicating with its environment. An outstanding property of these pericellular coats is their dynamic self-organization into strongly hydrated and gel-like meshworks. Tailor-made model systems that are constructed from the molecular building blocks of pericellular coats can help to understand how the coats function.

Die geheimnisvolle Hülle lebender Zellen

<b>Abb. 1:</b> (a) Illustration der Eireifung. Die gelartige Zuckerhülle um die Eizelle – engl. Cumulus Cell-Oocyte Complex Matrix, COC Matrix – ist e Bild vergrößern
Abb.1: (a) Illustration der Eireifung. Die gelartige Zuckerhülle um die Eizelle – engl. Cumulus Cell-Oocyte Complex Matrix, COC Matrix – ist essenziell für den Transport der Eizelle im Eileiter und für die Befruchtung. (b) Lichtmikroskopische Aufnahme einer Eizelle mit COC Matrix. [weniger]

Die Natur hat in Millionen von Jahren komplexe Materialien hervorgebracht, die in exquisiter Weise spezifische Funktionen ausüben. Eine eher unscheinbare, biologisch jedoch sehr wichtige Materialklasse sind die gelartigen, wasser- und zuckerreichen Hüllen, mit denen sich viele Zelltypen ausstatten. Die menschliche Eizelle zum Beispiel umgibt sich kurz vor dem Eisprung mit einer dicken Zuckerhülle, die die Aufnahme in den Eileiter ermöglicht und später Spermien einfangen hilft (Abb. 1). Auch die gelartigen Eigenschaften des von Knorpelzellen produzierten Knorpels sind essenziell für die Druckbeständigkeit und Schmierung der Gelenke.

<b>Abb. 2:</b> Hyaluronan und hyaluronanbindende Proteine. (a) Molekularstruktur von Hyaluronan. (b) Die Hyaluronankette ist flexibel und bildet in Wa Bild vergrößern
Abb.2: Hyaluronan und hyaluronanbindende Proteine. (a) Molekularstruktur von Hyaluronan. (b) Die Hyaluronankette ist flexibel und bildet in Wasser ein ungeordnetes Zufallsknäuel. (c) Die Bindung von Hyaluronan an die Zelloberfläche und an hyaluronanbindende Proteine kann verschiedenste supramolekulare Strukturen erzeugen. Hypothetische Strukturen sind hier schematisch gezeigt. Die Rekonstruktion solcher Strukturen in vitro erlaubt quantitative Einblicke in die supramolekulare Organisation und Dynamik sowie die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Zellhüllen. [weniger]

Obwohl diese Zuckerhüllen wichtige Rollen in elementaren biologischen Prozessen spielen, wissen wir nur sehr wenig über ihre interne Organisation und wie sie funktionieren. Die Untersuchung perizellularer Hüllen stellt auch heute noch eine Herausforderung dar. Ihre internen Strukturen sind mit herkömmlichen Methoden kaum sichtbar zu machen, da sie schlecht geordnet, extrem wasserhaltig und dynamisch sind. Eine essenzielle Komponente vieler perizellularer Hüllen ist Hyaluronan, ein langkettiger Zucker von bis zu mehreren Mikrometern Länge (Abb. 2a-b) [3]. Darüber hinaus enthalten die Hüllen eine Reihe von Proteinen, die an Hyaluronan binden und dabei verschiedenste supramolekulare Strukturen erzeugen können (Abb. 2c). Von Interesse sind die physikalischen Gesetzmäßigkeiten, die der Organisation und Funktion dieser Hüllen zugrunde liegen. Dafür ist es wünschenswert, von lebenden Zellen mit ihrer komplexen Dynamik zu kontrollierten Modelsystemen mit regelbarer Komplexität wechseln zu können.

Rekonstruktion von Zuckerhüllen im Labor – Lego mit Molekülen

Etablierte biochemische Methoden erlauben es, die einzelnen Komponenten der Zuckerhüllen zu identifizieren, sie aus dem natürlichen Gewebe zu isolieren oder im Labor herzustellen. Ziel ist es nun, diese Bausteine wieder zu maßgeschneiderten Modellsystemen zusammenzufügen. Die Natur hat die Moleküle so entworfen, dass sie spezifische Bindungen miteinander eingehen. Ähnlich wie in einem Legobaukasten passen nur gewisse Bausteine zusammen. Mit wenigen Bausteintypen lassen sich jedoch viele verschiedene Bauwerke konstruieren.

Der so reizvolle Vergleich zwischen den Zuckerhüllen und einem Lego-Bauwerk hinkt jedoch in zwei wichtigen Punkten. Im Gegensatz zu Legobausteinen können die Moleküle in der Zuckerhülle sich spontan voneinander trennen und ständig neue Bindungen eingehen. Zudem sind die Zuckerketten nicht starr sondern flexibel und können also verschiedenste Formen annehmen. Diese Eigenschaften erklären, weshalb die Zuckerhüllen weich sind und sich beständig umorganisieren, wenn sich die äußeren Umstände ändern. Die Fähigkeit zur Selbstorganisation ist eine essenzielle Komponente der Zuckerhüllen.

Um aus der Vielzahl von möglichen Strukturen die gewünschte herzustellen, müssen die Bausteine in der richtigen Konzentration und in der richtigen Reihenfolge miteinander in Verbindung gebracht werden. Die Herausforderung ist also, Bedingungen zu schaffen, die es den Molekülen erlaubt, sich so zusammenzusetzen, wie sie es in der Natur auch tun. Ein äußerst hilfreiches Werkzeug dazu ist die Biofunktionalisierung von Oberflächen. Biomoleküle werden so auf einer Oberfläche wie zum Beispiel Glas oder Gold aufgebracht, dass ihre Verteilung, Dichte und Orientierung kontrolliert werden kann. Zusätzlich muss dafür gesorgt werden, dass die Oberfläche passivierende Eigenschaften hat, da viele Biomoleküle die Tendenz haben, unspezifisch an Oberflächen klebenzubleiben.

<b>Abb. 3:</b> Wie kann man eine Zuckerhülle künstlich nachbauen? (a) Eine Glasoberfläche wird zu diesem Zweck mit einer Lipidmembran funktionalisiert Bild vergrößern
Abb.3: Wie kann man eine Zuckerhülle künstlich nachbauen? (a) Eine Glasoberfläche wird zu diesem Zweck mit einer Lipidmembran funktionalisiert [4]. Die Lipidmembran ähnelt der Zellmembran und sorgt dafür, dass die meisten Biomoleküle nicht an der Oberfläche haften können. Mittels spezieller Lipide, die eine Biotingruppe (gelb markiert) tragen, kann jedoch der Proteinlinker Streptavidin spezifisch gebunden werden. Biotinfunktionalisiertes Hyaluronan wird dann mit einem seiner Enden am Proteinlinker verankert. (b) Mit der Quarzkristallmikrowaage (QCM-D) lässt sich jeder Schritt in diesem Prozess zeitaufgelöst verfolgen [5]. [weniger]

Die langen Hyaluronanketten lassen sich zum Beispiel mit einem ihrer Enden an der Oberfläche verankern, indem man sie künstlich mit einer Ankergruppe versieht (Abb. 3). Da Hyaluronan ein flexibles und wasseranziehendes Molekül ist, formt es in Wasser ein lockeres Zufallsknäuel (ähnlich wie weichgekochte Spaghetti im Kochtopf, Abb. 2b). Auch wenn ein Kettenende an der Oberfläche befestigt wird, bleibt dieses Zufallsknäuel erhalten. Ist die Dichte der verankerten Ketten jedoch hoch genug, entsteht Gedränge und die Zuckerketten beginnen, sich von der Oberfläche weg zu strecken. Eine solche Struktur wird trefflich als (Polymer-) Bürste bezeichnet (Abb. 3). Auch Zellen sind in der Lage, Hyaluronan mit einem Ende an ihrer Oberfläche zu verankern, und das Modellsystem ahmt also natürliche Verhältnisse ganz passend nach.

Untersuchungsmethoden unter Wasser

Wasser ist ein essenzieller Bestandteil der Zellhüllen. Wird das Wasser entzogen, fallen die Zellhüllen in sich zusammen und verlieren ihre charakteristischen mechanischen und dynamischen Eigenschaften. Aus diesem Grund sind Methoden gefragt, die es ermöglichen, die Zellhüllen in wässriger Umgebung zu untersuchen. Das interdisziplinäre Feld der Grenzflächenforschung hat in den letzten Jahrzehnten eine ganze Reihe von Methoden entwickelt, mit denen verschiedenste Parameter von dünnen biomolekularen Filmen quantifiziert werden können.

<b>Abb. 4:</b> Mithilfe eines „Werkzeugkastens“ grenzflächensensitiver und biophysikalischer Methoden lassen sich viele Eigenschaften der Modellsystem Bild vergrößern
Abb.4: Mithilfe eines „Werkzeugkastens“ grenzflächensensitiver und biophysikalischer Methoden lassen sich viele Eigenschaften der Modellsysteme im Detail untersuchen und quantifizieren. [weniger]

Diese Methoden sind jedoch oft für ganz andere Anwendungen, etwa in der Biosensorik, konzipiert worden. Auch vermag es keine dieser Techniken allein, ein ausreichend detailliertes Bild der Struktur und Dynamik der Zuckerhüllen zu geben. Um den Hüllen die gewünschte Information zu entlocken, ist es nötig, existierende Methoden anzupassen und geschickt miteinander zu verknüpfen. Dies erfordert eine enge Zusammenarbeit zwischen Biochemikern, Materialwissenschaftlern und Physikern. Mit einem Werkzeugkasten von Methoden (Abb. 4) lassen sich nun zum Beispiel die Filmdicke und die Elastizität der Filme präzise ausmessen. Auch die Einlagerung zuckerbindender Proteine lässt sich zeitaufgelöst quantifizieren.

Dynamische Selbstorganisation

<b>Abb. 5: </b>Verschiedene biologische Bausteine regulieren die Morphologie von Zuckerfilmen. Aggrekan führt zu einer starken Schwellung des Hyaluron Bild vergrößern
Abb.5: Verschiedene biologische Bausteine regulieren die Morphologie von Zuckerfilmen. Aggrekan führt zu einer starken Schwellung des Hyaluronanfilms von 500nm auf 3µm. TSG-6 hingegen induziert die Quervernetzung und den Kollaps des Films. [weniger]

Je nach Typ und Menge der eingelagerten molekularen Bausteine können die Zuckerfilme verschiedenste Formen und Eigenschaften annehmen, und sich dynamisch umorganisieren. Das Molekül Aggrekan zum Beispiel ähnelt einer mikroskopisch kleinen Flaschenbürste und bindet mit einem seiner Enden an Hyaluronan. Die Zugabe dieses Bausteins führt zu einer drastischen Schwellung des Zuckerfilms (Abb. 5). Die resultierende Dicke des Films deutet darauf hin, dass die Hyaluronanketten nun nahezu vollständig gestreckt sind, und das sich eine hierarchische Bürstenstruktur geformt hat. Solche Strukturen können eine große Menge von Wasser halten. Als Wasserspeicher spielen sie eine wichtige Rolle für die Druckbeständigkeit und Schmiereigenschaften des Gelenkknorpels.

Ein gegensätzlicher Effekt konnte beobachtet werden, wenn das Protein TSG-6 zu Hyaluronanfilmen gegeben wird. Dieses Molekül vernetzt die Zuckerketten untereinander offenbar so stark, dass der gesamte Film kollabiert. TSG-6 wird ausschließlich bei Entzündungsprozessen produziert. Die Vermutung liegt nahe, dass der Kollaps von Hyaluronan eine wichtige Rolle in der Steuerung von Entzündungsprozessen spielen könnte [3].

Dank maßgeschneiderter Modellsysteme und einer Palette von Untersuchungstechniken ist es nun möglich, den Zusammenhang zwischen der supramolekularen Organisation und Dynamik, den physikalisch-chemischen Eigenschaften und den biologischen Funktionen perizellularer Hüllen direkt zu untersuchen [6]. Aktuelle Hypothesen zur Funktionsweise der Hüllen können direkt getestet und neue Hypothesen entwickelt werden. Die Modelloberflächen können mit lebenden Zellen in Verbindung gebracht werden, um deren Verhalten zu studieren und gezielt zu steuern. Die entwickelten Strategien sollten auch für viele andere hydrogelartige biologische Schichten, wie zum Beispiel Schleim oder Biofilme, nützlich sein und stellen damit einen neuartigen Ansatz im Feld der Glykobiotechnologie dar.

1.
A. Salustri, C. Fulop:
Role of Hyaluronan during Ovulation and Fertilization.
2.
A. Salustri, C. Garlanda, E. Hirsch, M. De Acetis, A. Maccagno, B. Bottazzi, A. Doni, A. Bastone, G. Mantovani, P. Beck Peccoz, G. Salvatori, D. J. Mahoney, A. J. Day, G. Siracusa, L. Romani, A. Mantovani:
PTX3 plays a key role in the organization of the cumulus oophorus extracellular matrix and in in vivo fertilization.
3.
A. J. Day, C. A. de la Motte:
Hyaluronan cross-linking: a protective mechanism in inflammation?
4.
R. P. Richter, R. Bérat, A. R. Brisson:
The formation of solid-supported lipid bilayers - an integrated view.
5.
R. P. Richter, K. K. Hock, J. Burkhartsmeyer, H. Boehm, P. Bingen, G. Wang, N. F. Steinmetz, D. J. Evans, J. P. Spatz:
Membrane-Grafted Hyaluronan Films: a Well-Defined Model System of Glycoconjugate Cell Coats.
6.
P. M. Wolny, S. Banerji, C. Gounou, A. R. Brisson, A. J. Day, D. G. Jackson, R. P. Richter:
Analysis of CD44-hyaluronan interactions in an artificial membrane system: insights into the distinct binding properties of high and low molecular weight hyaluronan.
 
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